Visualization and Quantification of MicroRNA in a Single Cell Using Atomic Force Microscopy

Hyunseo Koo, Ikbum Park, Yoonhee Lee, Hyun Jin Kim, Jung Hoon Jung, Joo Han Lee, Youngkyu Kim, Joung-Hun Kim and Joon Won Park

 

MicroRNAs (miRNAs) play critical roles in controlling various cellular processes, and the expression levels of individual miRNAs can be considerably altered in pathological conditions such as cancer. Accurate quantification of miRNA at the single-cell level will lead to a better understanding of miRNA function. Here, we present a direct and sensitive method for miRNA detection using atomic force microscopy (AFM). A hybrid binding domain (HBD)-tethered tip enabled mature miRNAs, but not premature miRNAs, to be located individually on an adhesion force map. By scanning several sections of a micron-sized DNA spot, we were able to quantify the copy number of miR-134 in a single neuron and demonstrate that the expression was increased upon cell activation. Moreover, we visualized individual miR-134s on fixed neurons after mem-brane removal and observed 2–4 miR-134s in the area of 1.0 ´1.0 μm² of soma. The number increased to 8–14 in stimulated neurons, and this change matches the ensemble-averaged increase in copy number. These findings indicate that miRNAs can be reliably quantified at the single cell level with AFM and that their distribution can be mapped at nanometric lateral resolution without modification or amplification. Furthermore, the analysis of miRNAs, mRNAs, and proteins in the same sample or region by scanning sequentially with different AFM tips would let us accurately understand the post-transcriptional regulation of biological processes

 

본 연구진은 원자힘 현미경의 단일 분자 간 상호작용력 측정 방법으로 생체 내 생물학적 기능을 제어하고, 다양한 질병과 밀접한 관계가 있는 microRNA를 높은 민감도로 정량 분석할 수 있는 방법을 개발 하였다. 이 방법은 생명과학과 김정훈 교수님 연구실로부터 제공 받은 RNA/DNA duplex를 선택적으로 인지할 수 있는 hybrid binding domain (HBD)을 제공 받아, 이 분자가 고정되어 있는 AFM cantilever를 제작하여 사용한 force-mapping 방법으로 세포 수준의 miRNA의 정량 분석이 가능함을 확인 하였으며, 자극을 가한 경우, miR-134의 발현량이 늘어나는 것 또한 이미지 상으로 확인 하였다.

  현재 상용화 되어 있는 역전사 효소 중합 연쇄 반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용한 biomarker 정량 분석법은 가장 높은 민감도를 보이고 있지만, miRNA strand의 짧은 길이로 인하여 증폭 오류로 인한 문제점을 동시에 가지고 있는데, 본 기술은 세포 내 극미량 존재하는 miRNA (~ 500 ea)를 증폭 과정 없이, 높은 정확도를 가지고 정량 할 수 있다는 장점이 있다. 앞으로 본 기술이 활용된다면, 세포 내 생물학적 메커니즘 규명 및 단일 세포 진단 분야에 유용하게 활용 될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구결과는 2016년 8월, 미국 화학회지 (Journal of the American Chemical Society)에 게재 되었다.